Fasecontrast-belichting met een helderveld-condensor

Introductie

Normaal gesproken is er voor een fasecontrast-belichting een speciale fasecontrast-condensor nodig. Zulke condensoren zijn over het algemeen vrij prijzig en kosten tweedehands al gauw 100 – 200 euro. Wanneer men een microscoop heeft met 1 of meer fasecontrast-objectieven maar geen fasecontrast-condensor dan is er toch een mogelijkheid om het fasecontrast-effect te verkrijgen met een normale helderveld-condensor. Ik heb al eerder een mogelijkheid daartoe hier beschreven: Een low-budget condensor voor donkerveld, fasecontrast en ringvormige belichting.

Een andere mogelijkheid is het gebruik van een objectglaasje waarop een ronde zwarte sticker wordt aangebracht. Het beste is het om aan beide kanten van het objectglas een zwarte sticker aan te brengen. De optimale diameter van de zwarte sticker kan per type microscoop verschillen, voor Zeiss Standard bijvoorbeeld heb ik stickers met een diameter van 12 mm en 19 mm gebruikt voor resp. Ph1 en Ph2/Ph3 objectieven. Deze ronde stickers zijn verkrijgbaar bij een kantoorboekhandel. Het zal waarschijnlijk niet veel uitmaken als er van deze diameter 1-2 mm wordt afgeweken, dat wordt dan weer door een andere hoogte-instelling van de condensor gecompenseerd.

In plaats van objectglaasjes kunnen ook 32 mm ronde glaasjes die in de filterhouder passen worden gebruikt. Het nadeel hiervan is echter dat men minder vrij is in het centreren van de zwarte sticker. Daarom heeft de objectglas-methode de voorkeur.

Om het fase-contrast effect te testen kan men het beste wangepitheelcellen als materiaal gebruiken. Hiervoor wordt met een tandenstoker langs één of beide wangen geschraapt en het materiaal wordt vervolgens in een kleine druppel water gesuspendeerd. Hieronder volgen enkele experimenten met verschillende typen microscopen.

Zeiss Standard

Bij een Zeiss-Standard met klap-condensor NA 0.9 wordt een objectglas gebruikt dat beplakt wordt met 12 mm of 19 mm zwarte ronde stickers. De stickers worden asymmetrisch op het objectglas geplakt, dus niet in het midden. Het objectglas wordt nu op de filterhouder geplaatst, de kant waar de stickers het dichtst bij de rand zitten wijst naar binnen. Voor Ph1 objectieven wordt een objectgas met 12 mm stickers gebruikt, voor Ph2 en Ph3 objectieven een objectgas met 19 mm stickers. De werkwijze is nu als volgt:

1. Stel de microscoop in volgens Köhler zodat alles gecentreerd is

2. Plaats het objectglas op de filterhouder

3. Open het veld-diafragma en condensor-diafragma volledig en zet de condensor in de hoogste positie

4. De front-lens van de condensor 0.9 wordt opzij geklapt bij Ph1 en Ph2 objectieven, voor Ph3 objectieven blijft de frontlens in de stralengang

5. Bekijk met een fase-telescoop de uitgangs-situatie

6. Positioneer het objectglas zodanig dat de zwarte cirkel gecentreerd is

7. Laat de condensor zakken totdat er binnen de fase-ring van het objectief geen licht meer zichtbaar is, de zwarte cirkel van het objectglas wordt eventueel na-gecentreerd

8. Sluit het condensor-diafragma totdat er buiten de fase-ring van het objectief geen licht meer zichtbaar is

9. Alleen de fase-ring van het objectief is nu zichtbaar en fasecontrast is nu ingesteld

Let op: als er een hulplens aanwezig is dan moet deze worden uitgeklapt als er al een extra lens in de condensor is geschroefd. Bevat de condensor geen extra lens, dan moet een eventueel aanwezige hulplens in de stralengang worden geklapt.

Links: condensor 0.9 met opzij geklapte frontlens bij Zeiss Standard 16. Het objectglas is hier op de filterhouder geplaatst. Daaronder bevind zich de hulplens die hier ingeklapt is. Rechts: objectglaasjes beplakt met 19 mm en 12 mm stickers.

Belichting van de fase-ring van een Zeiss Neofluar 40/0.75 Ph2 gefotografeerd door een fase-telescoop. Links: condensor met uitgeklapte front-lens in bovenste positie, veld-diafragma en condensor-diafragma maximaal geopend. Midden: condensor omlaag gedraaid totdat binnen de fase-ring geen licht meer aanwezig is. Rechts: condensor-diafragma wordt langzaam gesloten totdat alleen de fase-ring nog zichtbaar is.

Wangepitheelcellen in fasecontrast gefotografeerd met Neofluar 40/0.75 Ph2. Links: met Zeiss fasecontrast condensor II/Z NA 0.9. Rechts: met helderveld klapcondensor NA 0.9 en objectglas-methode. Het resultaat van beide methodes is vergelijkbaar.

Het fasecontrast-effect kan met Ph2 objectieven ook worden bereikt door een objectglas met 12 mm stickers op de licht-uitgang te plaatsen. Het voordeel van deze methode is dat het objectglas beter toegankelijk is waardoor het centreren gemakkelijker wordt. En wanneer er bij een Zeiss Standard geen filterhouder aanwezig is kan op deze manier toch nog fasecontrast worden verkregen. De kwaliteit van het fasecontrast is aan de rand van het beeldveld mogelijk iets minder dan als het objectglas zich direct onder de condensor bevind.

Zeiss Standard junior

Bij de Zeiss Standard Junior met klap-condensor 0.9 wordt eveneens de bovenbeschreven methode gevolgd. Hier hoeft echter niet als eerste stap de Köhler-instelling gedaan te worden omdat er geen veld-diafragma en centreerbare condensor aanwezig zijn. En een hulplens ontbreekt eveneens bij de Standard Junior.

Belichting van de fase-ring van een Zeiss Neofluar 40/0.75 Ph2 met klapcondensor NA 0.9 gefotografeerd door een fase-telescoop. Links: objectglas met 19 mm sticker, nog niet gecentreerd. Midden: zwarte sticker gecentreerd en condensor op juiste hoogte. Rechts: condensor-diafragma gesloten totdat alleen de fase-ring nog zichtbaar is.

 

Links: objectglas met 19 mm stickers geplaatst op de filterhouder. Rechts: wang-epitheelcellen gefotografeerd in fasecontrast met Carl Zeiss 40/0.65 Ph2 en objectglas-methode.

Olympus 37 mm objectieven

Olympus microscopen met 37 mm objectieven zoals bijvoorbeeld Olympus model E, FH of GB hebben meestal een condensor NA 1.25. Bij deze condensor kan de top-lens eraf gedraaid worden en voor het fasecontrast effect met de objectglas-methode is dit nodig. Voor 40x fasecontrast-objectieven heb ik 12 mm ronde stickers gebruikt. Voor 100x fasecontrast-objectieven zijn grotere stickers nodig en heb ik 19 mm gebruikt. Het objectglas kan op drie plaatsen aangebracht worden: op de condensor (zonder top-lens), op de filterhouder of op de lamp. Met 10x fasecontrast-objectieven zijn stickers nodig die kleiner zijn dan 12 mm. Met deze objectieven heb ik niet kunnen testen. Maar voor fasecontrast zijn de objectieven 40 en 100 het meest zinvol.

Objectglaasje met 12 mm stickers geplaatst op de condensor zonder top-lens (links) of op de lamp (rechts) van een Olympus FH.

Belichting van de fase-ring van een Olympus PL 40/0.65 fasecontrast-objectief gefotografeerd door een fase-telescoop. Links: objectglas met 12 mm sticker gecentreerd. Midden: condensor op juiste hoogte, volledige verduistering binnen de fase-ring. Rechts: condensor-diafragma gesloten totdat alleen de fase-ring nog zichtbaar is.

Wangepitheelcellen gefotografeerd in fasecontrast met Olympus PL 40/0.65 en objectglas-methode.

Conclusie

Met behulp van een objectglas en zwarte ronde stickers kan op eenvoudige wijze fasecontrast-belichting worden gerealiseerd zonder dat daar een speciale fasecontrast-condensor voor nodig is.