Sinds de ontwikkeling van digitale camera's is micro-fotografie een stuk gemakkelijker geworden. Je kunt nu onbeperkt foto's nemen en het resultaat direct bekijken. Dat geeft veel meer mogelijkheden met betrekking tot het optimaliseren van de opnames. Een goede opname begint met een goede belichting en dat kan niet vaak genoeg gezegd worden. Dat er een eenvoudige compact camera of een dure systeemcamera wordt gebruikt is eigenlijk minder relevant. En het is eveneens niet noodzakelijk om de microscoop uit te rusten met objectieven die de hoogste correctie-graad bezitten zoals (plan)apochromaten. Een goede belichting is meer dan al het andere verantwoordelijk voor een goede microscoop-foto.

Micro-fotografie is heel iets anders dan macro-fotografie. Met micro-fotografie gaan we een flinke stap verder en om goede microscopische opnames te maken is kennis van microscopie noodzakelijk. De microscoop is het belangrijkste instrument, niet de camera. Bij micro-fotografie gaat het niet alleen om mooie foto's maken maar ook om de inhoud ervan en het vergaren van kennis en informatie. Een minder mooie foto hoeft daarom niet minder waardevol te zijn.  Hier worden enkele mogelijkheden beschreven om te fotograferen door een microscoop en wat daarvoor nodig is.

Eindig-optiek en oneindig-optiek

Er wordt een onderscheid gemaakt tussen microscopen met ‘eindig’-optiek en microscopen met ‘oneindig’-optiek. Bij eindig-optiek convergeren de lichtstralen nadat ze het objectief hebben verlaten, bij oneindig-optiek verlaten de lichtstralen het objectief parallel. Bij microscopen van gerenommeerde merken was eindig-optiek de standaard tot ongeveer de jaren 90. Daarna werd overgegaan tot oneindig-optiek, te herkennen aan het oneindig symbool (∞) dat op de objectieven staat geschreven. Bij hedendaagse merkloze microscopen en eenvoudige microscopen voor het onderwijs is eindig-optiek meestal nog de standaard en hier staat op de objectieven het getal 160 waarmee de mechanische tubuslengte in millimeter aangegeven wordt. De mechanische tubuslengte van oudere microscopen van gerenommeerde merken was meestal 160 mm of 170 mm. Voor wie microfotografie als hobby gaat doen zullen microscopen met eindig-optiek het meest aantrekkelijk zijn, zowel financieel als ook uit puur praktische overwegingen. Op internet is een overvloed aan onderdelen en lenzen te vinden voor eindig-microscopen, zowel nieuw als tweedehands en dat voor aantrekkelijke prijzen. Wie met ‘oneindig’-microscopen aan de slag gaat heeft vaak een hoger budget nodig. Het verschil tussen de beide typen microscopen kan gevolgen hebben voor de manier van fotografie.

Microfotografie kan op verschillende manieren bedreven worden:

1. Afocale fotografie: met behulp van een lens wordt het beeld van het oculair op de camera-sensor geprojecteerd. Wanneer we door een microscoop kijken gebeurt eigenlijk hetzelfde: de ooglens zorgt ervoor dat het beeld van het oculair op het netvlies wordt geprojecteerd. Fotografie met smartphone, tablet, compact camera, webcam en systeemcamera met camera-lens zijn voorbeelden van afocale fotografie. Bij gebruik van een smartphone en compact camera is een speciale foto-tubus of trinoculaire microscoop geen vereiste. Hiermee kan gewoon door een normaal oculair van een monoculaire of binoculaire miroscoop gefotografeerd worden en dat kan zowel bij microscopen met eindig-optiek als met oneindig-optiek. Is er een foto-tubus aanwezig, dan kan een systeemcamera ingezet worden waarbij men bij ‘eindig’-microscopen dan bij voorkeur een camera-objectief met vaste brandpuntsafstand (prime lens) inzet. De zogenaamde Pancake lenzen zijn hiervoor zeer geschikt omdat ze kort van opbouw zijn. Bij ‘oneindig’-microscopen met foto-tubus wordt echter alleen de body van een systeemcamera gebruikt.

Voor goede afocale fotografie met eindig-microscopen is de combinatie objectief-oculair belangrijk. Zie hiervoor ‘De juiste objectief-oculair combinatie'.

2. Focale fotografie: er bevindt zich geen lens tussen oculair en camera-sensor en bij een systeemcamera wordt dan alleen de body gebruikt. Om op deze manier met ‘eindig’-microscopen te kunnen fotograferen is er een speciaal projectief of foto-oculair nodig dat het normale oculair vervangt. Maar ook sommige gewone oculairen van het betere type kunnen gebruikt worden voor focale fotografie. Originele projectieven en foto-oculairen voor eindig-microscopen van gerenommeerde merken zijn vaak moeilijk te vinden en er wordt op de tweedehands markt veel geld voor gevraagd. Een uitstekend alternatief zijn de zogenaamde hybride oculairen: ‘Microfotografie met ‘hybride’ oculairen’. Een ander alternatief is het gebruik van verlengde oculairen: ‘Verlengde oculairen als projectief voor microfotografie’. Bij microscopen met oneindig-optiek wordt het beeld van het objectief door de zogenaamde tubuslens gecorrigeerd en op de camera-sensor geprojecteerd dus bij dit type microscopen wordt uitsluitend een camera-body of speciale microscoop camera gebruikt.

3. Directe projectie: het beeld van het microscoop-objectief wordt direct, zonder tussenkomst van andere optiek, op de camera-sensor geprojecteerd. Er bestaan microscoop-adapters zonder inwendige optiek voor systeemcamera’s die in plaats het het normale oculair in de tubus worden geplaatst. Het beeld van het microscoop-objectief wordt dan direct op de sensor geprojecteerd. De methode is beperkt bruikbaar voor microscopen met ‘eindig’-optiek omdat er geen correctie van het beeld plaatsvind. De methode wordt soms gebruikt voor macro-fotografie waarbij een microscoop-objectief via een speciale adapter direct met de camera verbonden wordt. Voor deze toepassing zijn beter gecorrigeerde oneindig-objectieven met lage vergroting populair, met name de volledig uit-gecorrigeerde Nikon objectieven. Maar ook eindig-objectieven met lage vergroting die nauwelijks correctie nodig hebben kunnen hiervoor gebruikt worden.Sommige USB oculair-camera’s bezitten geen interne optiek en ze worden i.p.v. het normale oculair in de tubus geplaatst. In dat geval is er ook directe projectie, er wordt echter maar een zeer klein gedeelte van het microscoop-veld gefotografeerd en soms kunnen er ‘hotspots’ optreden.

Al deze methoden hebben hun sterke en zwakke punten. Welke methode het meest geschikt is hangt sterk af van persoonlijke voorkeuren en toepassingen. Voor kwalitatieve microfotogafie met ‘eindig’-microscopen in combinatie met een systeemcamera gaat mijn voorkeur uit naar focale fotografie omdat deze methode zowel mechanisch als optisch minder complex is als de afocale methode.

Heel veel camera's zijn tegenwoordig geschikt voor micro-fotografie. Laten we eens beginnen met de camera die bijna iedereen constant op zak heeft: de smartphone. De kwaliteit van smartphone camera' s is de laatste jaren sterk verbeterd zodat ze nauwelijks nog onderdoen voor een compact camera en er kunnen zeer aardige micro-foto's mee worden gemaakt. Smartphones hebben een kleine lens en dat is een voordeel met betrekking tot de keuze van het oculair waardoor men wil fotograferen. Met zo'n kleine lens kun je namelijk heel dicht bij de frontlens van een oculair komen. Veel Huygens oculairen hebben een lage uittree-pupil waardoor je met een DSLR camera bij gebruik van een camera-objectief bijna onmogelijk het ronde gezichtsveld scherp in beeld kunt krijgen. De intree-pupil van veel systeem-camera lenzen ligt vrij diep en valt daardoor niet samen met de uittree-pupil van de meeste Huygens oculairen. En zelfs met sommige compact camera's wordt het al lastig om door een Huygens oculair te fotograferen. Wil je met dat soort camera's fotograferen dan heb je bij voorkeur een groothoek oculair (wide field, WF) met hoge uittree-pupil nodig. Met een smartphone is met alle oculairen de rand van het ronde gezichtsveld scherp in beeld te krijgen.

De eenvoudigste manier om met een smartphone door een microscoop te fotograferen is door de lens van de smartphone zodanig boven het oculair te houden totdat je het microscopisch gezichtsveld als een scherp omrande cirkel ziet. Dit vergt in het begin wat oefening, vooral ook om de telefoon stabiel te houden. De truc is om de middelvinger van de linkerhand (het dichtst bij de lens) tegen de microscoop tubus aan te houden wat zorgt voor ondersteuning. Het is makkelijker om door een Huygens oculair te fotograferen omdat je daarbij dichter bij de frontlens komt. Bij groothoek oculairen moet je de smartphone al gauw een paar cm van de lens houden zodat je moeilijker met een hand kunt ondersteunen. Er zijn smartphone adapters te koop die je aan de microscoop-tubus kan bevestigen en waarin je de telefoon kunt klemmen. Op die manier is het mogelijk om alles live op het scherm van de telefoon te bekijken. Ik gebruik zelf een adapter van Celestron (Basic Smartphone Adapter, 1.25”). Omdat een smartphone een kleine sensor heeft zal de foto geen heel grote resolutie hebben, tenminste, vergeleken met een systeem camera. De kwaliteit van het beeld kan nog verbeterd worden door een hoger vergrotend te oculair nemen, bijvoorbeeld een 15x i.p.v. het gebruikelijke 10x oculair. De gedachte hierachter is dat de sensor een kleiner deel van het beeld opneemt waardoor het hele sensor oppervlak wordt gebruikt voor het vastleggen van informatie van dit deel. Details worden dus beter vastgelegd. Je kunt foto's die op deze manier zijn genomen ook wat meer uitvergroten voordat ze "korrelig" worden. Het is goed om te realiseren dat er minder pixels nodig zijn naarmate de objectief-vergroting stijgt. Een beeld gemaakt met een 40/0.65 objectief bevat minder informatie dan dat van een 10/0.25 objectief. Met objectieven met hogere vergrotingen worden dus de beste resultaten bereikt.

Hieronder volgen enkele beelden die ik heb gemaakt met een smartphone, de Samsung Galaxy A8 (SM-A530F, 16 MP, 1/2.8", 2018) en de Samsung Galaxy A3 (SM-A300FU, 8 MP, 2015).

Oogflagellaten met rode oogvlek (Euglena) en blauwalgen (Anabaena) gefotografeerd met de Samsung Galaxy A8. Optiek: Carl Zeiss Neofluar 40/0.75 met oculair Kpl12.5x W.

Cellen van waterpest (Elodea) met talrijke chloroplasten. Foto gemaakt met de Samsung Galaxy A3. Zeiss-Winkel achromaat 40/0.65 en Olympus P15x oculair.

Opname van filamenteuze algen (Spirogyra en Mougeotia) gemaakt met de Samsung Galaxy A3. Zeiss Neofluar 63/1.25 objectief met Zeiss Kpl12.5x oculair. Digitale zoom: 2x.

De beperkingen van een smartphone worden pas duidelijk wanneer fijne details gefotografeerd moeten worden. Wanneer dan ook nog een objectief wordt gekozen waarmee het een uitdaging is om deze details op te lossen dan kan het zijn dat ze met een smartphone slecht of nauwelijks zichtbaar zijn. De volgende afbeeldingen laten een vergelijking zien tussen een systeem-camera en de Samsung Galaxy A8 aan de hand van objecten met fijne details.

Zetmeelkorrels in de cellen van banaan gefotografeerd met de Olympus PEN E-PL1 (links) en Samsung Galaxy A8 (rechts). Links zijn de fijn gelaagde structuren in de zetmeelkorrels beter zichtbaar ondanks het feit dat de Olympus PEN minder pixels heeft. Rechts zijn er meer overbelichte gedeeltes. De grotere sensor van de Olympus PEN heeft een beter dynamisch bereik. Objectief: Zeiss 25/0.45.

Pleurosigma angulatum gefotografeerd met Carl Zeiss objectief 40/0.65 en oculair Kpl12.5x. Links: Nikon 1 J1, 10 Mp. Rechts: Samsung Galaxy A8, 16 Mp. Op het eerste gezicht lijkt de foto rechts duidelijker, maar schijn bedriegt. Bij het uitvergroten van de foto wordt duidelijk dat de structuur van de diatomee beter wordt weergegeven met de Nikon camera, ondanks het feit dat deze camera aanzienlijk minder megapixels bezit. De software van de meeste smartphones passen vaak een te sterke beeldbewerking toe waardoor de foto er contrastrijker en scherper uitziet maar dat leidt tevens tot meer artefacten in het beeld. Bij gebruik van een C8x oculair was de poriën-structuur met de Nikon 1 J1 camera nog steeds goed zichtbaar terwijl met de smartphone de poriën in het geheel niet zichtbaar konden worden gemaakt.

Pleurosigma angulatum gefotografeerd met Carl Zeiss Neofluar 40/0.75 en oculair Kpl12.5x. Links: Nikon 1 J1, 10 Mp. Rechts: Samsung Galaxy A8, 16 Mp. De poriën zijn nu met de Samsung smartphone beter zichtbaar als in de vorige afbeelding omdat een objectief met hogere apertuur is gebruikt. Maar nog steeds is de weergave en beeldkwaliteit van de Nikon camera duidelijk beter dan die van de smartphone.

Het ligt misschien niet zo voor de hand maar ook met een tablet kunnen foto's door een microscoop gemaakt worden. De uitdaging is hier om de tablet voor het oculair te houden en er is wat improvisatie voor nodig om dit te doen. Als de tablet op het oculair kan rusten dan zorgt dit voor de nodige stabiliteit. De onderstaande foto's werden gemaakt met de Huawei Mediapad T3, (5 Mp, 2017). De camera's in de meeste tablets hebben over het algemeen geen geweldige specificaties en om nog details te kunnen zien is het noodzakelijk om door een hoger vergrotend oculair te fotograferen, bijvoorbeeld 15x of meer, zeker bij objectieven ≤ 40.

Histologische preparaten van mens (links) en plant (rechts) gefotografeerd met de Huawei tablet. Objectieven: Zeiss-Winkel 100/1.3 (links) en Zeiss-Winkel 40/0.65 (rechts).

Een diatomee als Cymbella heeft geen heel fijne structuur en kan prima met een tablet gefotografeerd worden. De volgende afbeeldingen laten een vergelijking zien tussen de Olympus PEN systeem-camera en de Huawei tablet. Op het eerste gezicht is het verschil nauwelijks te zien. Pas bij uitvergroten  wordt duidelijk dat de foto genomen met de Olympus camera een hogere resolutie heeft.

Vergelijking tussen de Olympus PEN (boven) en Huawei tablet (onder) met een preparaat van Cymbella. Objectief: Leitz 40/0.65. Oculairen: Leitz Periplan GF 10x (Olympus PEN) en Leitz Periplan GF 16x (Huawei tablet).

Beelduitsnedes uit de vorige foto's. Olympus PEN (links) versus Huawei tablet (rechts). Objectief: Leitz 40/0.65. Oculairen: Leitz Periplan GF 10x (Olympus PEN) en Leitz Periplan GF 16x (Huawei tablet).

Pinnularia (links, Olympus 40/0.65) en Stauroneis (rechts, Zeiss-Winkel 40/0.65) gefotografeerd met de Huawei tablet door een Olympus 15x oculair.

Oculair-camera's zijn handig in het gebruik omdat ze dezelfde diameter als een oculair hebben. Je kunt ze gewoon in de tubus van de microscoop schuiven. Vaak bezitten oculair-camera's geen optische elementen en is er enkel een sensor aanwezig. Dit betekent dat het beeld dat door het objectief wordt gevormd direct op de sensor geprojecteerd word. Voor objectieven die berekend zijn voor een eindige mechanische tubuslengte kan dit een probleem zijn. In het beeld van de meeste objectieven die voor een eindige mechanische tubuslengte bedoeld zijn zitten nog restfouten die normaal gesproken door het oculair worden gecompenseerd. Omdat de oculair camera het oculair vervangt en er dus geen compensatie plaatsvind kunnen in er het beeld restfouten zitten. Dit wordt met name merkbaar bij beter gecorrigeerde objectieven en achromaten met een hogere vergroting. Bij achromaten met lage vergrotingen zullen er zeer weinig restfouten in het beeld te zien zijn omdat deze objectieven meestal nauwelijks compensatie van een oculair nodig hebben. Bij beter gecorrigeerde objectieven en achromaten met hoge vergroting zal het beeld alleen in het midden weinig chromatische fouten vertonen. Van kleine objecten die in het midden van het microscoopveld liggen kunnen dan nog wel redelijke opnames gemaakt worden. Onderstaande beelden zijn gemaakt met een BRESSER MikrOkular Full HD oculair camera, een goedkope camera met een kleine sensor. De sensor heeft een grootte van 5.86 x 3.28 mm (vergelijkbaar met de chips die in een smartphone zitten) en de camera heeft 2 Mp. Met deze specificaties kun je natuurlijk geen hoge kwaliteit verwachten maar je betaald er dan ook niet veel voor. Een nadeel van dit soort camera's is dat er maar een zeer klein gedeelte van het microscopisch beeld wordt opgenomen en dat de eindvergroting hoog is waardoor er een lege vergroting ontstaat. Toch is het bij gebruik van de lager vergrotende objectieven maar beter dat een klein gedeelte van het microscoopveld wordt gefotografeerd omdat daardoor meer pixels beschikbaar zijn voor het te fotograferen object. Dit komt de resolutie ten goede en met lager vergrotende objectieven zijn meer pixels nodig. Een camera als deze kan het beste gebruikt worden voor het fotograferen van organismen die maar een klein deel van het gezichtsveld in beslag nemen zoals protisten en dergelijke.

Gebruikt men een oculair-camera in combinatie met hybride oculairen dan kan er een groter gedeelte van het gezichtsveld worden gefotografeerd en worden tevens de rest-fouten in het beeld gecorrigeerd. Zie hiervoor: 'Hybride oculairen in combinatie met microscoop-camera’s'.

Gekleurd preparaat van een stengel, gefotografeerd met een BRESSER MikrOkular Full HD oculair camera. Deze camera heeft geen inwendige optiek. Rechts het beeldveld gezien door een oculair met veldnummer 18 en daarin aangegeven het zeer kleine gedeelte dat met deze oculair camera wordt gefotografeerd. Objectief: Zeiss-Winkel 10/0.25.

Diatomeeën (bovenste twee foto's) en ciliaten (onderste foto's) gefotografeerd met de BRESSER MikrOkular Full HD oculair camera en Carl Zeiss Apo 40/1.0. De beeldkwaliteit van dit soort objecten in het midden van het beeldveld is nog redelijk.

Als een oculair-camera zonder compenserende optiek wordt gebruikt dan worden betere resultaten bereikt met microscopen die oneindig-optiek hebben omdat daar het beeld al volledig uitgecorrigeerd is en er geen compensatie van een oculair of projectief nodig is. De volgende afbeelding is gemaakt met een Zeiss Axiostar (een microscoop met oneindig-optiek) waarbij de oculair-camera in de bino-tubus werd geplaatst. Natuurlijk wordt er dan nog steeds maar een klein gedeelte van het gezichtsveld gefotografeerd.

Cellen van een mos, gefotografeerd met de BRESSER MikrOkular Full HD oculair camera aan de Zeiss Axiostar. Objectief: CP-Achromat 40/0.65.

Met een goede webcam kunnen acceptabele foto' s worden gemaakt van eenvoudige preparaten en objecten die geen zeer fijne details bevatten. De resolutie van een webcam is beperkt. Met een webcam wordt het volledige gezichtsveld opgenomen en het aantal pixels moet hierover verdeeld worden. Het betekend dat met lage objectief-vergrotingen de foto's niet geweldig zullen zijn. Met de hogere vergrotingen lukt het nog aardig en de kwaliteit van de opname kan nog verbeterd worden door een oculair met een hogere vergroting dan 10x te nemen. Het beste kan een groothoek oculair (WF) met een vergroting van 12.5x-15x gebruikt worden. Voor puur documentatie volstaat deze methode prima. De onderstaande beelden heb ik met de Logitech C922 PRO HD Stream webcam opgenomen.

Pollen van een lelie (links) en een mitose-preparaat van ui (rechts) gefotografeerd met de Logitech C922 PRO HD Stream webcam. Objectief: Carl Zeiss 40/0.65. Oculair: Kpl W12.5x/18.

Links: mix van algen en schimmels in een monster genomen van een vochtig balkon. Objectief Carl Zeiss 100/1.25. Rechts: pollen van een lelie. Objectief Carl Zeiss 40/0.65. Foto's genomen met de Logitech C922 PRO HD Stream webcam door Kpl 12.5xW oculair.

Met een compact camera kunnen prima microscoop foto's worden gemaakt. Het handigst zijn de camera's met interne zoom, dus waarbij de lens niet naar buiten beweegt. Deze camera's kunnen dichtbij of zelfs tegen het oculair gehouden worden. Zelf heb ik lange tijd een Olympus Stylus 725 SW (7.1 Mp, 1/2.3" CCD, 2006) gebruikt. In het begin zette ik deze camera op een statief voor het oculair en dat werkte prima. Met oculairen die een lage uittree-pupil hebben kan zo´n camera tegen het oculair gehouden worden wat tevens zorgt voor ondersteuning.

Epidermis van Calathea rufibarba gefotografeerd met een Olympus Stylus 725 SW camera. Objectief: Leitz 100/1.25.

Filamenteuze algen gefotografeerd met de Olympus Stylus 725 SW camera. Objectief: Carl Zeiss Neofluar 25/0.60. Bij het selecteren van deze foto viel me op hoe goed de beeldkwaliteit is. En dat voor een oude compact camera met slechts 7.1 Mp.

Links: pollenkorrels van een stokroos gefotografeerd met Carl Zeiss Neofluar 25/0.60. De bovenste korrel is opengebarsten. Rechts: cellen van een mos gefotografeerd met Carl Zeiss 100/1.25. Camera: Olympus Stylus 725 SW.

Wil je het microscopische beeld nog beter vastleggen dan is een systeemcamera een betere keuze. Zowel met micro 4/3- als met DSLR crop sensor camera's (APS-C formaat) zijn uitstekende micro-foto's te maken. Maar ook met 1-inch sensor camera's worden goede resultaten behaald. Een full-frame camera is voor micro-fotografie eigenlijk niet nodig, mits je films van hoge kwaliteit wilt gaan maken. Er is een belangrijk aspect bij de keuze van een systeemcamera voor micro-fotografie: trillingen. Camera's met een mechanisch sluitermechanisme kunnen trillingen veroorzaken waardoor de foto onscherp wordt. Meer nog dan bij normale fotografie hebben trillingen bij micro-fotografie een grote impact omdat je met zulke hoge vergrotingen werkt. Zelf werk ik met o.a. een Olympus PEN E-PL1 (12.3 Mp, 4/3" CMOS, 2010), een Canon EOS 600D (18 Mp, CMOS APS-C, 2011) en een Nikon 1 J1 (10 Mp, 1" CMOS, 2012). Dit zijn alledrie wat oudere modellen die echter nog prima voldoen. De Olympus PEN veroorzaakt significante trillingen bij korte belichtingstijden. Deze camera heeft geen electronische sluiter, dit in tegenstelling tot de andere twee camera's. Naarmate de belichtingstijd langer wordt (2 sec of meer) wordt de invloed van het sluitermechanisme aanmerkelijk minder. Als ik de Olympus PEN gebruik dan fotografeer ik uitsluitend statische objecten omdat ik een belichtingstijd van 2.5 seconden hanteer. De Canon 600D heeft een electronische sluiter en maakt gebruik van de zogenaamde Electronic Front-Curtain Shutter (EFCS). Er ontstaan hierdoor geen trillingen gedurende de belichting en de opname wordt in LiveView gemaakt. De spiegel wordt eerst opgeklapt (mirror lock-up) en de foto wordt genomen voordat de spiegel naar beneden klapt. Bij de keuze van een DSLR camera voor microfotografie is het belangrijk om te checken of EFCS aanwezig is. Om handmatige trillingen te vermijden gebruik ik bij beide camera's de zelfontspanner, ingesteld op 2 seconden tussen het moment dat ik op de camera de knop indruk en de foto wordt genomen. Van Canon is er een aantal DSLR camera's uitermate geschikt voor micro-fotografie en deze beschikken over EFCS. Het gaat dan o.a. om de 450D, 500D, 550D, 600D, 650D, 700D en 750D.

Na de keuze voor een bepaalde camera volgt de koppeling van de camera met de microscoop. Micro-fotografie met een systeemcamera kan zowel met als zonder camera-objectief bedreven worden. De opzet zonder camera-objectief is wat eenvoudiger maar stelt wat hogere eisen aan het oculair dat gebruikt wordt om het beeld op de sensor te projecteren. Voor de Olympus PEN heb ik lange tijd een Sigma 30 mm objectief gebruikt en dat werkt prima. Deze lens heeft als voordeel dat er geen extern bewegende delen zijn als scherp gesteld wordt, alles gebeurt binnenin het objectief. Daardoor is het mogelijk om de lens ergens op te zetten. De volgende afbeelding laat een opzet met de Sigma lens zien die ik veel heb gebruikt met een hoefijzer-statief. Met een Ihagee klem-adapter en rubberen ring wordt een soort van plateau gecreëerd waar de camera opgezet kan worden. Door het gewicht van het objectief blijft de camera probleemloos staan. Het is een handige set-up voor een kantel-statief; nadat de foto gemaakt is wordt de camera van het plateau afgehaald en kan er verder gekeken worden. Een tweede voordeel van het Sigma objectief is de naar voren gelegen intree-pupil. Daardoor kan elk microscoop oculair gebruikt worden, ook de Huygens oculairen met lage uittree-pupil.

Olympus PEN E-PL1 met Sigma 30 mm objectief geplaatst op een Olympus hoefijzer-statief.

Om te kunnen fotograferen zonder camera-objectief is er een projectie-oculair (projectief) of speciaal foto-oculair nodig dat de restfouten in het beeld van het objectief compenseerd en vervolgens dit beeld op de sensor geprojecteerd. Dit is van toepassing op de meeste objectieven die op een eindige mechanische tubuslengte afgestemt zijn. Goede projectieven zijn echter schaars en soms vrij duur. Een normaal oculair kan ook dienst doen als projectief wanneer het enkele mm hoger in de foto-tubus geplaatst wordt. Het gebruik van een normaal observatie-oculair als projectief geeft bij de verschillende fabrikanten wisselende resultaten, varierend van goed tot ronduit slecht. Belangrijk is dat er een compenserend oculair wordt gebruikt, ook voor de achromaten met geringe vergrotingen. Het hoger plaatsen van een gewoon oculair in de tubus leidt tot een grotere mechanische tubuslengte in het systeem wat aberraties tot gevolg kan hebben. Toch is dit lang niet altijd het geval. Ik heb gemerkt dat beelden die gemaakt worden zonder tussenkomst van een camera-objectief soms wat contrastrijker zijn. Dat is ook vrij logisch, er zit minder glas in de optische stralengang waardoor minder lichtreflecties zullen ontstaan. Bovendien staat deze eenvoudigere opzet me veel meer aan. Hier worden enkele ervaringen beschreven met oculairen die redelijk goed als projectie-oculair kunnen worden gebruikt.

Bij het optimaliseren van een camera-opstelling is het belangrijk dat er een adapter wordt gebruikt die het mogelijk maakt om de afstand tussen oculair en camera-sensor te variëren. Het uiteindelijke doel is om het beeld wat de camera ziet zo goed als het kan gelijktijdig scherp te krijgen met het visuele beeld: de opstelling is dan parfocaal. Op de tweedehands markt is regelmatig de Exakta Ihagee microscoop adapter te vinden. Iets beters om een camera aan een microscoop mee te bevestigen bestaat er niet. Dit onderdeel is zeer degelijk uitgevoerd en werd geproduceerd in Dresden. Er is absoluut spelingvrije en stevige montage mee mogelijk.

Om te testen of een camera-aanpassing deugdelijk is gebruik ik zowel een object-micrometer als 'echte' preparaten. Als de optische afstemming niet klopt dan zullen allerlei afwijkingen in het beeld zichtbaar worden. Naast de object-micrometer gebruik ik vaak een preparaat met pollen omdat daarmee de chromatische aberratie vrij snel opvalt door blauw gekleurde randen rondom de pollenkorrels. Ook een vers planten-preparaat kan prima dienst doen om optische fouten op te speuren. Een preparaat van een mos bijvoorbeeld of de epidermis van Dracaena marginata. Deze laatste leent zich goed voor zulke testen doordat rondom de fijne ruitvormige kristallen chromatische aberratie snel zichtbaar wordt.

Zeiss-Winkel

Van Zeiss-Winkel bestaan speciale foto-oculairen waarvan ik er zelf een heb: een ‘Photo 12x’. De resultaten hiermee zijn redelijk maar er wordt slechts een klein deel van het microscopisch beeld mee gefotografeerd. Waar ik betere resultaten mee heb zijn de oudere Olympus WF10x oculairen, die bedoeld waren voor de Olympus 37 mm objectieven. Ik heb elders al beschreven dat Olympus oculairen en de sterkere Zeiss-Winkel achromaten visueel en voor afocale fotografie vrij goed matchen. Dit is dus ook het geval wanneer een WF10x als projectie-oculair wordt gebruikt, dus focaal. Testen met een object-micrometer en Zeiss-Winkel 25/0.45 en 40/0.65 objectieven laten weinig chromatische aberratie aan de randen van het beeld zien, zowel als het oculair enkele mm hoger in de tubus geplaatst wordt als in de normale positie. Ook met een Wild 6xPhot en Leitz Periplan GF10x (170 mm) zijn redelijk goede resultaten met afocale fotografie te bereiken. Wil men met de kleinste Zeiss-Winkel objectieven (2.5/0.06 en 4/0.10) afocaal fotograferen en een normaal oculair gebruiken dan zijn daar o.a. Olympus P7x- en P10x oculairen geschikt voor. Er moet dan wel redelijk wat na-gefocusseerd worden (heeft geen negatief effect op de beeldkwaliteit) en het gedeelte van het gezichtsveld dat gefotografeerd wordt is wat kleiner. Dit laatste heeft ook een voordeel: alleen het gedeelte dat scherp is wordt vastgelegd en bovendien is een sterkere na-vergroting met kleine objectieven soms wenselijk, zeker met een camera die niet al te veel pixels bezit.

De correctie van Zeiss-Winkel objectieven is zeer verschillend waardoor verschillende oculairen of projectieven nodig zijn om het beste uit elk objectief te halen. Wanneer normale oculairen voor focale fotografie ingezet worden moet er na-gefocusseerd worden en parfocaliteit tussen de objectieven gaat verloren. Beter is het om hybride oculairen te gebruiken. Hier blijft de parfocaliteit gewaarborgd en bovendien worden hiermee de beste resultaten behaald. Voor Zeiss-Winkel heb ik verschillende combinaties samengesteld, zie: Microfotografie met ‘hybride’ oculairen.

Blaadje van een mos gefotografeerd met een Zeis-Winkel 40/0.65 objectief. Met een Olympus WF10x oculair werd het beeld op de sensor van de Canon 600D geprojecteerd. De foto laat het volledige beeld zien en is niet bijgesneden. Beeldbreedte: ca. 300 μm.

Carl Zeiss Oberkochen

Hiervan zijn ook speciale foto-oculairen geproduceerd en ze werden aangeduid met ‘Fk’. Zelf bezit ik een Fk10x oculair. Hiervoor geldt hetzelfde als wat ik voor het Zeiss-Winkel foto-oculair heb beschreven: de resultaten zijn redelijk maar slechts een klein gedeelte van het beeld wordt gefotografeerd. Het gebruik van een normaal Carl Zeiss observatie-oculair als projectief geeft bij de objectieven van Zeiss Oberkochen naar mijn mening wisselende resultaten. Bij gebruik van bijvoorbeeld een Kpl10xW oculair treedt aan de beeldranden een sterke chromatische aberratie op, bij een KplW12.5x is dat minder. Verder bezit ik een Nikon HWK10x oculair dat redlijke resultaten geeft met oculair-projectie en de objectieven van Zeiss. Maar na wat geëxperimenteer ben ik uitgekomen op zogenaamde hybride oculairen oculair en hiermee ben ik nog het meest tevreden. Hoe deze oculairen zijn opgebouwd wordt hier beschreven: 'Microfotografie met 'hybride' oculairen'. Tot slot is er één objectief van CZ waarvoor men het beste een Olympus P7x- of P10x oculair kan gebruiken wanneer men hiermee focaal wil fotograferen: het 3.2/0.07 objectief.

Aansluiting van de Canon 600D op een Zeiss Standard. Projectie middels een hybride oculair.

Water uit een sloot waarin voornamelijk rust-stadia van Euglena te zien zijn. Foto gemaakt met een Carl Zeiss apochromaat 40/1.0 en schuine belichting. Het beeld werd met een hybride oculair zonder camera-optiek op de sensor van de Canon 600D geprojecteerd.

Leitz

Van Leitz zijn er speciale projectieven maar voor gebruik in de digitale fotografie heb ik ze nooit zo geschikt gevonden. Daarom heb ik ook voor Leitz hybride oculairen samengesteld uit verschillende onderdelen. Deze oculairen doen uitstekend dienst als projectief. Zie ook: 'Microfotogafie met 'hybride' oculairen'.

Aanpassing van de Canon 600D aan de Leitz Dialux II zonder camera-lens. Een hybride oculair fungeert als projectie-oculair.

Epidermis van Dracaena marginata gefotografeerd met een Leitz Planapo 25/0.65 aan de Leitz Dialux-II. Onscherpe gedeeltes ontstaan puur door de dikte van het preparaat en daardoor kunnen niet alle details tegelijkertijd in focus zijn. Bij dit soort kleine kristallen wordt een eventuele chromatische abberatie snel zichtbaar. Camera: Canon 600D.

Object-micrometer gefotografeerd met een Leitz NPL Fluotar 25/0.55 aan de Leitz Laborlux-12. Projectie met een hybride oculair. Camera: Canon 600D.

Aansluiting van de Olympus PEN E-PL1 camera aan de Leitz Laborlux-12. Rechts: Arachnoidiscus gefotografeerd met Leitz Fluotar 25/0.55.

Pollenkorrels van verschillende plantensoorten. Leitz Fluotar 25/0.55 in combinatie met een hybride oculair. Gefotografeerd met Olympus PEN E-PL1 camera op Leitz Laborlux-12.

Olympus

Olympus had speciale projectieven voor de fotografie: FK-projectieven voor de objectieven met 37 mm bouwlengte en NFK-projectieven voor de latere 45 mm objectieven. Zelf gebruik ik meestal hybride oculairen als projectief. Deze geven een net zo goed beeld als de originele Olympus projectieven.

De groene alg Closterium gefotografeerd met de Nikon 1 J1 camera aangesloten op een Olympus HSA microscoop. Een hybride oculair (L6-P10) werd als projectief gebruikt. Links-beneden in het beeld is een schaal-amoebe te zien. Objectief: Olympus F40/0.65.

Interessant is dat Olympus P-oculairen goed voor focale fotografie gebruikt kunnen worden in combinatie met de kleiner vergrotende achromaten (4/0.10 en 10/0.25). Met zowel een P7x als een P10x oculair werden goede resultaten verkregen met genoemde objectieven. De oculairen worden niet verhoogd in de tubus geplaatst en er wordt na-gefocusseerd totdat het beeld op de camera scherp is. Terwijl bij afocale fotografie de P-oculairen te sterk compenseren voor de kleiner vergrotende achromaten, werkt deze combinatie voor focale fotografie uitstekend.

Speciale microscoop (c-mount) camera's hebben een vrij kleine sensor waardoor er een reduceer-lens nodig is om een redelijk gedeelte van het gezichtsveld vast te leggen. Bij microscopen met eindig-optiek zal echter chromatische aberratie optreden wanneer zo'n reduceer-lens i.p.v. een compenserend oculair of projectief wordt gebruikt. De meeste projectieven die zijn gemaakt voor microscopen met eindig-optiek zijn echter beperkt inzetbaar doordat het beeld niet genoeg verkleint wordt. Een mogelijke oplossing is het gebruik van hybride oculairen. Voor onderstaande foto heb ik een 5 MP camera van Touptek gebruikt in combinatie met hybride oculair C8-ZW5-Kpl10, zie ook: 'Hybride oculairen in combinatie met microscoop-camera’s'. Met dit oculair vind compensatie plaats en wordt er een redelijk gedeelte van het gezichtsveld op de sensor geprojecteerd. De betere c-mount camera's zijn overigens nogal duur maar met de bijbehorende software kunnen allerlei metingen en beeldbewerkingen worden uitgevoerd. Wie echter hogere eisen stelt aan de kwaliteit van de foto's kan beter in een systeemcamera investeren.

Pollen van Clivia miniata gefotografeerd in schuine belichting met de 5 MP Toupcam van Touptek in combinatie met hybride oculair C8-ZW5-Kpl10. Objectief: Carl Zeiss 40/0.65.

De invloed van het type objectieven en condensor op de fotografische kwaliteit wordt vaak overschat. De kwaliteit van het preparaat en de belichting is veel meer van invloed op het beeld. Bovendien hangt het van het type preparaat af welk objectief nuttig ingezet kan worden. Een grotere werkafstand en scherpte-diepte is vaak belangrijker dan een hogere apertuur.

Objectieven met plan-correctie of niet?

Plan-objectieven vlakken de beeldveldkromming uit en zorgen er voor dat het beeld tot aan de rand scherp is. Deze objectieven worden bij voorkeur gebruikt bij zeer dunne en vlakke preparaten, bijvoorbeeld dunne weefselcoupes of gekleurde bloeduitstrijkjes. Het heeft weinig zin om een wat dikker preparaat dat niet vlak is te gaan bekijken met een plan-objectief. In zo'n preparaat heb je scherpe en onscherpe gedeeltes door verschillen in dikte waardoor sommige gedeeltes van het preparaat tot aan de rand scherp zullen zijn en andere gedeeltes weer niet. Ook voor onderzoek van bijvoorbeeld materiaal uit de sloot hebben zulke objectieven weinig meerwaarde. Daarbij komt dat plan-objectieven aanzienlijk duurder zijn dan objectieven zonder plan-correctie. Er zijn extra lenzen nodig zijn om alles tot aan de rand scherp te krijgen. Maar de beeldkwaliteit in het midden (daar waar je meestal naar kijkt en wat gefotografeerd word) kan met plan-objectieven nooit beter kan zijn dan met normale objectieven. Bij wat oudere objectieven die een niet zo goede anti-reflex coating bezitten kan de aanwezigheid van dit extra glas merkbaar zijn. Het beeld heeft dan wat minder contrast doordat door die extra lenzen meer reflecties en dus strooilicht ontstaat.

Zelf gebruik ik niet zo vaak objectieven met plan-correctie, behalve voor testen. Het idee dat er zoveel extra glas in deze objectieven zit, en dat alleen om wat rand-onscherpte te corrigeren, vind ik niet echt aantrekkelijk. Bovendien is mijn gedachte altijd: wat bekeken en gefotografeerd wordt ligt in het midden en niet aan de rand. Verder zie ik geen noodzaak om zoveel mogelijk van het beeldveld te fotograferen.

Achromaten, fluorieten of apochromaten?

Het idee dat je dure en hoog gecorrigeerde objectieven nodig hebt voor micro-fotografie is een fabel. In principe heb je niet meer nodig dan goede achromaten. Hiermee kunnen uitstekende foto's worden gemaakt. Zie ook 'Eerherstel voor de achromaat'. Wie met gewone achromaten geen bevredigende resultaten kan behalen doet iets fout. Er is altijd een compromis tussen scherpte-diepte en oplossend vermogen en het is zaak om er bij stil te staan welk objectief voor een bepaald type preparaat nuttig is. Een apochromaat met hoog oplossend vermogen stelt ook hoge eisen aan de kwaliteit van het preparaat. Hoe hoger het oplossend vermogen, hoe kleiner de scherpte-diepte en het kan zomaar zijn dat het beeld van een apochromaat enorm tegenvalt doordat de kwaliteit van het preparaat te wensen over laat. En zoals al eerder aangegeven, sommige planapochromaten kunnen dermate veel lenzen bezitten dat het koste gaat van het contrast, met name bij oudere optiek.

Als men beter gecorrigeerde objectieven wil gaan gebruiken dan zijn naar mijn mening de fluorieten (zoals bijvoorbeeld de Zeiss Neofluaren en Leitz Fluotaren ) een goede keus. Ze geven contrastrijkere beelden dan apochromaten en tonen minder chromatische aberratie dan achromaten.

Fluorieten en apochromaten zullen naar mijn mening nooit een volledige vervanging zijn voor achromaten, met name vanwege het verschil in scherpte-diepte.

De condensor

Soms leest men dat voor microfotografie in kleur een achromatische condensor aanbevolen wordt. Misschien dat hier in het pre-digitale tijdperk iets van waarheid in zat maar tegenwoordig is de invloed van sofware ter (kleur)verbetering van het beeld vele malen groter dan de achromatische correctie van een condensor. De meeste microscopen zijn standaard uitgerust met een twee-lenzige Abbe condensor die geen correctie bezit. Deze condensor is voor bijna alle doeleinden meer dan voldoende. De invloed van een achromatisch en eventueel aplanatisch gecorrigeerde condensor op het beeld wordt overschat, temeer ook omdat een condensor eigenlijk niet bijdraagt aan de totstandkoming van het beeld. Hoog gecorrigeerde condensoren zijn duur terwijl ze in de meeste gevallen weinig bijdragen aan de verbetering van het beeld. Dit soort condensoren zullen enkel nuttig zijn bij zeer kritische en hoge-resolutie microscopie waarbij het maximale aan oplossend vermogen moet worden behaald.

De oculairen

Oculairen zijn er in vele soorten en maten. Voor de fotografie is het belangrijk dat er onderscheid wordt gemaakt tussen compenserende oculairen en oculairen die niet of nauwelijks compenseren. Bij alle planachromaten, (plan)fluoriet en (plan)apochromaten is het raadzaam een compenserend oculair te gebruiken. Dit geld ook voor de eenvoudige achromaten met een vergroting van 20x of meer. Bij de lager vergrotende achromaten, 10x en kleiner, is het echter het beste (uitzonderingen daargelaten) om een oculair te gebruiken dat niet of nauwelijks compenseert. Compenserende oculairen worden vaak aangeduid met een 'C', K, 'P' of met andere lettercombinaties die het woord 'Foto/photo' of 'Kompensation/compensation' aangeven. Maar het kan ook zijn dat deze aanduidingen er niet op staan. Op de WF10x oculairen voor de Olympus 37 mm objectieven staat bijvoorbeeld alleen 'WF'. Maar deze oculairen zijn wel degelijk compenserend. Bij twijfel is het verstandig om de optische specificaties van de fabrikant op te zoeken. En het is belangrijk om kritisch naar het beeld te kijken: hoe ziet het microscoopbeeld er aan de rand uit? Bij een mismatch tussen objectief en oculair treden chromatische aberratie en vervorming aan de rand van het gezichtsveld op. Meestal is het raadzaam om objectieven in combinatie met oculairen van dezelfde fabrikant te gebruiken. Maar er zijn ook genoeg combinaties van verschillende fabrikanten die een goed beeld geven. De compensatie blijft echter het belangrijkst. Een 40/0.65 objectief zal vaker een beter beeld opleveren met een compenserend oculair van een andere fabrikant dan met een niet-compenserend oculair van dezelfde fabrikant. Zie ook: 'De juiste objectief-oculair combinatie'.

Welk oculair het beste ingezet kan worden hangt ook nog af van de fotografische methode die men gebruikt. Zo ben ik er achter gekomen dat de laag vergrotende achromaten (zonder plan-correctie!) en dan met name de overzichts-objectieven 2.5x, 3.2x en 4x voor focale fotografie vaak een compenserend oculair nodig hebben. Dit geldt in ieder geval voor Olympus- en Leitz objectieven met 37 mm lengte, Zeiss-Winkel en de 3.2/0.07 achromaat van Carl Zeiss. Wordt er met deze objectieven afocaal gefotografeerd, dan is er juist een oculair nodig dat nauwelijks compenseert.

In het volgende experiment heb ik wit zand gefotografeerd met een Olympus 4/0.10 objectief (korte bouwlengte), zowel op de focale als afocale manier. Daarbij heb ik voor beide methoden zowel een oculair gebruikt dat nauwelijks compenseert (Olympus 10x) als een compenserend oculair (Olympus P10x). De opnames werden gemaakt met de Olympus PEN E-PL1 en voor de afocale methode werd er een Sigma 30 mm lens gebruikt.

Wit zand zowel met de afocale als focale methode gefotografeerd met Olympus 4/0.10 achromaat. Linksboven: afocaal met Olympus 10x oculair. Linksonder: afocaal met Olympus P10x oculair. Rechtsboven: focaal met Olympus 10x. Rechtsonder: focaal met Olympus P10x. De beste resultaten worden behaald door met een Olympus P10x oculair focaal te fotograferen. Zowel plan-correctie als contrast zijn hier het beste. Ik heb daarbij het P10x oculair in zijn normale positie in de tubus geplaatst en gewoon na-gefocusseerd. De verschillen zijn het meest duidelijk aan de randen te zien.

Uitvergrotingen van linker-rand van de originele foto' s. Van links naar rechts: afocaal met Olympus 10x, focaal met Olympus 10x, afocaal met Olympus P10x, focaal met Olympus P10x. Hier is bij de minder ideale combinaties duidelijk chromatische aberratie zichtbaar in de vorm van blauwe kleur-artefacten. Vooral wanneer met een Olympus 10x oculair focaal wordt gefotografeerd zijn de artefacten goed te zien.

Met beeldbewerkings software kunnen structuren en details in microscoop foto's nog beter naar voren worden gebracht. Met name contrast verbetering doet veel. Zelf gebruik ik hier het programma RawTherapee voor. Ik ben vrij voorzichtig met beeldbewerking, met name witbalans, contrast en belichting worden met mate aangepast. Ik ben van mening dat een foto er al vanaf het begin redelijk goed moet uitzien, zonder enige bewerking. Het is prima om in het beeld zichtbare hinderlijke vlekjes weg te werken die veroorzaakt zijn door stofdeeltjes die op een lens of de camera sensor hebben gezeten. Persoonlijk ben ik er geen voorstander van dat bepaalde details in een foto worden gewist, alleen om het onderwerp waar het om gaat er mooier uit te laten zien. Als er bijvoorbeeld algen uit de sloot gefotografeerd worden en die zijn omringd met bacteriën, dan horen die bacteriën er gewoon bij. Dit zijn de algen in hun natuurlijke leefomgeving die ze delen met andere organismen. Juist de onderlinge grootte-verhoudingen van verschillende organismen in hetzelfde beeld geeft veel meer betekenis aan dat beeld.

Op mijn website probeer ik zoveel mogelijk te benadrukken dat met relatief eenvoudige en niet al te dure apparatuur goede resultaten te behalen zijn. Ik ben er van overtuigd dat met een klein budget zeer veel mogelijk is. Als je met deze hobby begint dan wil je niet gelijk veel geld uitgeven. Dit houd ik ook altijd in mijn achterhoofd bij het geven van advies aan mensen voor wie dit allemaal nieuw is. Het is een groot misverstand om te denken dat dure microscoop-camera’s en geavanceerde microscopen nodig zijn voor goede microfotografie. Dit komt ook ter sprake in het artikel 'Wat je kunt zien met een eenvoudige microscoop'.

Wie bereid is gebruikte apparatuur aan te schaffen komt met een klein geldbedrag uit. Goede compact camera's en systeemcamera’s zijn tweedehands voor 50-150 euro te vinden en eigenlijk heb je niet meer dan een body nodig. Het is ook belangrijk om te realiseren dat je voor microfotografie in de meeste gevallen niet veel megapixels nodig hebt. Met 5-10 Mp kun je met hogere vergrotingen goede foto’s maken. Soms zie je op forums mensen die willen beginnen met microfotografie en dan gelijk het duurste en het beste willen aanschaffen. Zo werkt het niet. Er is een leercurve en die volg je het beste door te beginnen met een eenvoudige uitrusting. Bovendien geeft het veel meer voldoening om met eenvoudige apparatuur goede resultaten te behalen en steeds weer iets te bedenken waardoor deze verbeterd worden. Een zeer leerzaam traject. Less is more!