Met een normale helderveld-belichting wordt een preparaat van alle kanten gelijkmatig belicht. Wanneer het licht slechts van ëën kant komt spreekt men van schuine belichting (Engels: oblique illumination). Bij schuine belichting ontbreekt veel van het licht dat normaal gesproken recht door het preparaat valt. De belichtings-techniek is zeer oud en werd vroeger al gebruikt om de zichtbaarheid van preparaten te verhogen.

Bij schuine belichting wordt het contrast en dus de zichtbaarheid van details vergroot. Er ontstaat vaak een pseudo-driedimensionaal effect dat diepte geeft aan structuren waardoor deze beter zichtbaar worden.

Schuine belichting kan op heel veel verschillende manieren gerealiseerd worden. Door gewoon al een vinger tussen lichtbron en condensor te houden wordt een soort van scheve belichting bereikt. In principe leidt elke ingreep in de stralengang die resulteert in een ongelijkmatige verlichting tot schuine belichting. Een beproefde methode om schuine belichting mee te krijgen is een donkerveld-stop of fasecontrast-condensor. Ook kan een extra lens onder de condensor tot een goede schuine belichting leiden als deze wordt verschoven.

Zeiss Standard GFL

Voor onderstaande testen heb ik een preparaat gebruikt van Pleurosigma angulatum en een Zeiss-Winkel achromaat 40/0.65. Voor een 40/0.65 objectief is Pleursigma angulatum een kritisch object; bij onjuiste instellingen is de poriën-structuur van deze diatomee niet zichtbaar. Het is dus een goed test-preparaat om het oplossend vermogen van een 40/0.65 mee te controleren. De experimenten zijn gedaan met een Zeis Standard GFL en een NA 0.9 Abbe condensor. De schuine belichting heb ik op verschillende manieren gerealiseerd waarbij telkens een ander onderdeel verschoven werd. Belangrijk is om altijd het veld-diafragma en apertuur-diafragma volledig te openen. Tijdens het testen is het tevens belangrijk om met een fase-telescoop de verlichting aan de achterkant van het objectief te bekijken en dit vast te leggen zodat later dezelfde instellingen kunnen worden herhaald. De mate waarin iets wordt verschoven en de hoogte van de condensor hebben een drastisch effect op het resultaat en het is zaak om hiermee zoveel mogelijk te experimenteren. Afbeelding 1 laat enkele onderdelen aan de Standard GFL zien die zijn gebruikt om de belichting mee te manipuleren.

Afb.1. Methodes om schuine belichting mee te bereiken. A: Donkerveld-stop 18 mm in filterhouder. B: Hulplens. C: Vatting filterhouder. D: Gekantelde top-lens van condensor.

De volgende beelden van Pleurosigma angulatum werden gemaakt door de schuine belichting op verschillende manieren uit te voeren. Het effect van elke methode op de verlichting van de objectief-apertuur werd met behulp van een fase-telescoop gefotografeerd en is weergegeven in afbeelding 5 (genummerd 1 t/m 6).

Afb.2. Pleurosigma angulatum in normale helderveld-belichting (links, instelling 1) en schuine belichting middels een donkerveld-stop in de filterhouder (rechts, instelling 2). Rechts is de fijne structuur van deze diatomee veel beter zichtbaar.

Afb.3. Schuine belichting door de condensor te decentreren (links, instelling 3) of door de hulplens onder de condensor te verschuiven (rechts, instelling 4).

Afb.4. Schuine belichting door de condensor toplens te kantelen (links, instelling 5) of door de vatting van de filterhouder in de stralengang te positioneren (rechts, instelling 6).

Afb.5. Overzicht van de verschillende instellingen. 1: Helderveld belichting. 2: Donkerveld-stop 18 mm. 3: Decentreren condensor. 4: Hulplens onder condensor verschoven. 5: Toplens condensor gekanteld. 6: Vatting filterhouder in stralengang. Helemaal rechts is de mate van verlichting bij de instellingen aan de achterkant van het objectief te zien, gefotografeerd door een fase-telescoop.

Persoonlijk vind ik dat in bovenstaand experiment het beste contrast en oplossend vermogen werd verkregen door de hulplens te verschuiven (4) of door een donkerveld-stop in de filterhouder te plaatsen (2). De structuur van Pleurosigma angulatum wordt met deze twee methodes naar mijn mening het beste opgelost. Daarentegen geeft het decentreren van de condensor met deze instelling (3) de minste kleur-artefacten en een nagenoeg gradiënt-vrije schuine belichting.

Naast een verbetert contrast en oplossend vermogen heeft schuine belichting een positief effect op de scherpte-diepte. Tevens wordt er een pseudo-reliëf gecreëerd wat goed te zien is in de volgende afbeelding.

Arachnoidiscus ehrenbergii gefotografeerd in helderveld (links) en schuine belichting (rechts). Objectief: Zeiss-Winkel 25/0.45.

De meest bevredigende resultaten bereik ik door een lens op de licht-opening van de Zeiss Standard GFL te plaatsen. De lens die ik hiervoor heb gebruikt was afkomstig van een Carl Zeiss Jena (1.2 N.A.) Abbe condensor. De top-lens heb ik eraf geschroefd en de onderste lens (de veldlens) plaats ik asymmetrisch op de licht-opening. De condensor van de Zeiss Standard GFL wordt helemaal naar boven gedraaid en het apertuur-diafragma wordt volledig geopend. Ook het diafragma van de licht-uitgang wordt maximaal geopend. Vervolgens wordt de veldlens op de licht-opening geplaatst en dusdanig verschoven totdat een bevredigend resultaat wordt bereikt. De positie van de veldlens stel ik dusdanig in zodat er een niet al te sterke belichtings-gradiënt in het beeld ontstaat terwijl er tegelijkertijd genoeg scherpte-diepte moet worden gecreëerd om de objecten plastisch te laten verschijnen. Met een beetje experimenteren worden resultaten bereikt die veel lijken op Differentieel Interferentie Contrast (DIC).

Methode voor het verkrijgen van schuine belichting door de stralengang aan de licht-opening te beïnvloeden. De veldlens van een Carl Zeiss Jena condensor werd geplaatst op de licht-opening van een Zeiss-Winkel Standard GF. De lens wordt naar linksboven verschoven zodat er een schuine belichting ontstaat.

Pediastrum, gefotografeerd in helderveld (links) en schuine belichting (rechts, enkelvoudige opname) zoals boven beschreven. Objectief: Carl Zeiss Apo 40/1.0. Bij de opname met schuine belichting werd de apertuur van het objectief tot ongeveer 0.8 gereduceerd d.m.v. het diafragma in het objectief. Camera: Canon EOS 600D.

Ik heb wat geëxperimenteerd met schuine belichting met de Leitz Dialux II en het Leitz Fluotar objectief 25/0.55. Het test-preparaat was van de diatomee Cymbella en de schuine belichting werd op 5 verschillende manieren verkregen:

1: De fasecontrast condensor 402a werd op de helderveld-positie een beetje verdraaid, dus gedecentreerd.

2: Op de lamp-opening werd een matglas gelegd en vervolgens werd daarop een diafragma, niet helemaal centrisch, geplaatst.

3: Zoals bij methode 2, maar nu werd de positie van het diafragma verhoogd door het op een stuk plastic buis te plaatsen.

4: Op de lamp-opening werd een matglas gelegd en daarop een zwarte schijf, in dit geval een knop van de grof-afstelling van een microscoop.

5: De donkerveld-stop van de fasecontrast condensor werd licht gedecentreerd.

Het introduceren van schuine belichting op de Leitz Dialux II middels methoden 2, 3 en 4.

Test met schuine belichting op een preparaat van Cymbella. A: normale helderveld-belichting. 1-5: schuine belichting op verschillende manieren gerealiseerd zoals boven beschreven.

Met een goede schuine belichting wordt het contrast en de zichtbaarheid van fijne details verhoogd. Schuine belichting kan met eenvoudige middelen gerealiseerd worden. Sommige methodes werken beter dan andere. Met schuine belichting kan de scherpte-diepte aanmerkelijk worden vergroot. Het geeft een ruimtelijkere indruk van het object en sommige details komen beter naar voren dan in normaal helderveld belichting. Als je naar foto's kijkt die met schuine belichting zijn gemaakt dat kan er een plotselinge omkering van het relief plaatsvinden; holtes lijken ineens uitstulpingen. Dit is een optische illusie. Het is een goede gewoonte om ook altijd een opname in helderveld belichting te maken en het te vergelijken met het beeld dat is gemaakt met schuine belichting.